Poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE) üretim süreci temel olarak jel hazırlama, elektroforez işlemi, boyama ve sonucun gözlemlenmesi gibi adımları içerir.
Jel hazırlığı Ayırma jeli (%10) hazırlığı: 0 ml ddH₂O, 3 mL %30 stok jel, 5 mL 5 mol/L Tris-HCl, 1 mL %10 SDS ve 1 mL %10 AP'yi karıştırın, tabanı kapatmak için 10 μL TEMED ekleyin ve ardından 4 μL TEMED ekleyip iyice karıştırın. Bu karışımı cam plakaların arasına dökün, üstünü suyla kapatın ve jelin tamamen polimerleşmesi için 30~60 dakika bekleyin.
Yığınlama jeli (%4) hazırlığı: 4 ml ddH₂O, 33 ml %30 stok jel, 25 mL 1 mol/L Tris-HCl, 0,2 ml %10 SDS ve 0,2 ml %10 AP'yi karıştırın, 2 μL TEMED ekleyin ve hemen iyice karıştırın. Ayırma jelinin üzerine suyu dökün, bu karışımı ekleyin ve tarağı hemen cam plakaların arasına yerleştirin, istifleme jelinin tamamen polimerleşmesi için 15-30 dakika bekleyin.
Elektroforez işlemi Numune tedavisi: Numuneyi eşit miktarda 2XSDS yükleme tamponu ile karıştırın, 100 derecede 3-5 dakika ısıtın ve ardından 12.000 rpm'de 1 dakika santrifüj edin ve süpernatantı SDS-PAGE analizi için alın.
Yükleme: 10 μL uyarılmış ve uyarılmamış numune alın ve bunları örnek havuzuna ekleyin ve kontrol olarak 20 μL düşük moleküler ağırlıklı protein standartlarını ekleyin.
Elektroforez: Elektroforez tankına 1X elektroforez tamponu ekleyin, güç kaynağını bağlayın, istifleme jelinin voltajını 60V'da ve ayırma jelinin voltajını 100V'da tutun. Bromofenol mavisi elektroforez tankının dibine ulaştığında elektroforezi durdurun (yaklaşık 3 saat).
Boyama ve sonuç gözlemi
Boyama: Jeli cam plakadan çıkarın ve oda sıcaklığında 4 ila 6 saat boyunca Coomassie Brilliant Blue boyama solüsyonuyla boyayın. Boya giderme: Boyalı jeli boya giderme solüsyonuna yerleştirin ve protein bandı açıkça görünene kadar birkaç kez boyadan arındırın. Sonuçların gözlemlenmesi: Boyanın çıkarılmasından sonra jelin fotoğrafı çekilip saklanabilir. Boyama adımı tamamlandıktan sonra jeli fotoğraf çekmek için görüntü işleme sisteminin altına yerleştirin ve sonuçları bir diskete kaydedin.